Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド及び肝臓に化合物を特異的に送達するためのビヒクルとしてのそれらの使用

专利摘要:
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで肝臓、好ましくは肝細胞に化合物を特異的に送達するための汎用ビヒクルである、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドに関する。任意の種の化合物、特に例えばインターフェロン、ウイルス逆転写酵素阻害剤又はコアアセンブリ阻害剤、及び／又はラベル等の薬物が、肝臓を特異的に標的とすることができ、このようにして肝臓で濃縮される。さらにこの肝臓標的化を、肝疾患又は肝障害、例えば肝炎、マラリア、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）を標的とする診断、予防及び／又は治療に、並びにＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及び／又はＨＤＶの感染予防に使用することができる。本発明は、上記疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと肝臓に特異的に送達される化合物とを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、肝疾患の治療とＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及び／又はＨＤＶの感染予防とを組み合わせる方法に関する。本発明は、遺伝子治療、及び肝臓指向性の免疫反応を活性化させる肝細胞媒介性の抗原提示のための免疫原性エピトープの送達におけるｐｒｅＳ由来ペプチドの使用にも関する。なし
公开号:JP2011512123A
申请号:JP2010543441
申请日:2009-01-26
公开日:2011-04-21
发明作者:ウルバン，シュテファン；ハベルコルン，ウーヴェ；ミエル，ヴァルター
申请人:ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルクＲｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで肝臓、好ましくは肝細胞に化合物を特異的に送達するための汎用ビヒクルであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドに関する。任意の種の化合物、そのなかでも特に、インターフェロン、ウイルス逆転写酵素阻害剤又はコアアセンブリ阻害剤などの薬物及び／又はラベルは肝臓を特異的に標的とすることができ、そして肝臓で濃縮される。さらにこの肝臓標的化を、肝疾患又は肝障害、例えば肝炎、マラリア、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）を標的とする診断、予防及び／又は治療に、並びにＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及び／又はＨＤＶの感染予防に使用することができる。本発明は、上記疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと肝臓に特異的に送達される化合物とを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、肝疾患の治療とＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及び／又はＨＤＶの感染予防とを組み合わせる方法に関する。本発明は、遺伝子治療、及び肝臓指向性の免疫反応を活性化させる肝細胞媒介性の抗原提示のための免疫原性エピトープの送達におけるｐｒｅＳ由来ペプチドの使用にも関する。]
背景技術

[0002] 脊椎動物及び他の動物に存在する器官である肝臓は、代謝において主要な役割を果たし、グリコーゲン貯蔵、赤血球の分解、血漿タンパク質の合成及び解毒を含む、身体における多くの機能を有する。また肝臓はヒトの身体で最も大きな腺である。肝臓は腹部の胸郭部における横隔膜の下にある。肝臓は、脂質の乳化を介して、消化を助けるアルカリ化合物である胆汁を産出する。また肝臓は、特殊な組織を必要とする多種多様な大量の生化学反応を行うと共に調節する。]
[0003] 肝細胞は肝臓の細胞質塊の７０％〜８０％を構成している。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質貯蔵及び炭水化物の変換、コレステロール、胆汁塩及びリン脂質の合成、並びに外因性物質及び内因性物質の解毒、変性及び排出に関与する。また肝細胞は胆汁の生成及び分泌を開始する。]
[0004] 数多くの既知の肝疾患、例えば
肝炎：主に様々なウイルスにより引き起こされるが、或る特定の毒、自己免疫又は遺伝性疾患によっても引き起こされる肝臓の炎症、
肝硬変：死滅肝臓細胞を置き換える、肝臓における線維組織の形成（肝臓細胞の死滅は、例えばウイルス性肝炎、アルコール依存症又は他の肝毒性の化学物質への接触により引き起こされ得る）、
ヘモクロマトーシス：身体において鉄の集積を引き起こし、最終的には肝臓損傷をもたらす遺伝性疾患、
肝臓の癌：通常胃腸管の他の部分に由来する、原発性の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）又は胆管癌腫及び転移性癌、
ウィルソン病：銅が身体に保持される遺伝性疾患、
原発性硬化性胆管炎：事実上自己免疫性である胆汁管の炎症性疾患、
原発性胆汁性肝硬変：細胆汁管の自己免疫疾患、
バッド・キアリ症候群：肝静脈の閉塞、
ジルベール症候群：集団の約５％に見られるビリルビン代謝の遺伝障害、
ＩＩ型糖原病：全身の進行性の筋力低下（ミオパシー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓及び神経系で様々な身体組織に影響を与えるグリコーゲンの蓄積、
が存在する。]
[0005] 多くの小児肝疾患、例えば胆道閉鎖症、α−１−抗トリプシン欠乏症、アラジール症候群及び進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、並びに代謝性疾患も存在する。]
[0006] さらに、特に熱帯病の病原体及び寄生生物によってはその生活環の中に肝臓段階を有する。]
[0007] 例えばマラリアは最も一般的な感染性疾患の１つであり、多大な公衆衛生の問題がある。マラリアは、プラスモジウム（Plasmodium）属の寄生原生動物により引き起こされる。]
[0008] 最も重症な型の疾患は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodiumfalciparum）及び三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）により引き起こされるが、他の関連種（卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodiummalariae）及び場合によっては二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesi））がヒトに感染する可能性もある。この群のヒト病原性のマラリア原虫種は通常、マラリア寄生生物と呼ばれる。マラリア寄生生物は、雌のハマダラカ（Anopheles mosquitoes）により伝播される。ヒトにおいてマラリアは二相で発症する：赤血球外相（肝臓相又は「肝臓段階」）及び赤血球相。感染した蚊が人の皮膚を刺し、吸血すると、蚊の唾液中の種虫が血流に入り、肝臓へと移動する。ヒト宿主に導入されておよそ３０分以内に、種虫が肝細胞に感染し、６日間〜１５日間、無性的に及び無症候性で増殖する。一度、肝臓でこれらの生物が分化し、数千ものメロゾイトが得られると、宿主細胞が破壊された後、血液中へと流出し、赤血球に感染する。このようにして生活環の赤血球段階が始まる。寄生生物は、感染した宿主肝臓細胞の細胞膜において自身を包み込む（wrapping）ことによって検出されることなく肝臓から流出する。寄生生物は、身体の免疫系による攻撃から比較的保護されるが、これはヒト生活環のほとんどで、寄生生物が肝臓及び血球内に存在し、免疫学的監視に比較的探知されないためである。血液段階の発症を未然に防ぐために、マラリア寄生生物の肝臓特異的段階に特異的に対処する薬物（例えばプリマキン）を開発することへの関心が高まっている。]
[0009] 別の例は、数種の扁形動物により引き起こされる寄生虫性疾患である、住血吸虫症又はビルハルツ住血吸虫症である。住血吸虫症は死亡率が低いが、非常に衰弱性であり得る。住血吸虫症は寄生性の扁形動物（住血吸虫）による血液の感染に起因する、慢性的であることが多い病気である。住血吸虫症は衰弱をもたらし、肝臓及び腸の損傷を引き起こす。住血吸虫症はアジア、アフリカ及び南アフリカ、特に寄生生物を含有する淡水貝で汚染されている水を用いる地域で最も一般的に見られる。]
[0010] Ｂ型肝炎の原因となるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、哺乳類及び鳥類の小さいエンベロープ（enveloped）ＤＮＡウイルスファミリーの原型である（１）。ＨＢＶエンベロープは、Ｌ−（大型（large））タンパク質、Ｍ−（中型（middle））タンパク質及びＳ−（小型（small））タンパク質と呼ばれる３つのタンパク質を取り囲んでいる（図１Ａ）。３つのタンパク質は、４つの膜貫通領域を有するＣ末端のＳ−ドメインを共有する。Ｍ−タンパク質及びＬ−タンパク質は、５５個のアミノ酸のさらなるＮ末端伸長と、遺伝子型に依存した１０７個又は１１８個のアミノ酸とを保有する（ｐｒｅＳ２−及びｐｒｅＳ１）（図１Ｂ）。ビリオンでは、Ｌ−タンパク質、Ｍ−タンパク質及びＳ−タンパク質の化学量論比は約１：１：４であり、より豊富に分泌される非感染性のサブウイルス粒子（ＳＶＰ）はほぼ独占的にＳ−タンパク質を含有し、Ｌ−タンパク質はほんのわずかしか含有しない（２）。合成中、Ｌ−タンパク質のｐｒｅＳ１−ドメインがミリストイル化し、ＨＢＶ生活環の幾つかの時点でＥＲ由来膜を通して位置を変える。この修飾は感染性に必須である（３、４）。ＨＢＶ及び他の肝指向性ウイルスは向肝性を有し、すなわち肝臓はＨＢＶの成長を特異的に支持する組織である。] 図１Ａ 図１Ｂ
[0011] 薬物の特異的な標的化は、治療の有効性の改善を目的としている。１９０６年、PaulEhrlichは、最適な治療戦略の追及のための「特効薬（magic bullet）」という表現を導入した。それ以来、薬物標的化という意味での研究は、腫瘍又は病原体等の標的組織における薬物の治療濃度を増大させ、これにより全体として生物に対する副作用を低下させる担体系の開発に焦点を当ててきた。理想的に、薬物標的化は以下の基準を満たさなければならない：１）要求される作用部位への薬物の排他的送達、２）残りの組織（organism）に対する最小の効果、３）薬理学的に不活性であるベクターの使用。]
[0012] 特定の組織に薬物を送達するために、様々な戦略が追究されている。これらは例えば、プロドラッグの使用であり、このプロドラッグから薬理学的に活性な部分が、組織特異的な酵素により標的組織に放出される。さらなる可能性としては、効果がある非組織特異的な薬物と、受容体−アフィンペプチド又はコロイド粒子のような、組織特異的であるが、薬理学的に不活性な担体系とを合わせることである。]
[0013] 様々な薬物担体を、薬物の肝臓標的化を高めるのに使用している。直接的なアプローチは、薬物、特に担体、例えばリポソーム及びミクロスフェアを送達することによる肝臓における網内系の活性食作用を基にしている。例えば、静脈内注射の後に、薬物が組み込まれた微粒子担体が主に肝臓における網内系で捕捉され、これにより肝臓の薬物標的化がもたらされることが示されている（５）。他方で、正に荷電した水溶性ポリマーによる薬物の肝臓標的化は、肝臓の血管系からのほとんどの水溶性物質の自由溢出と、肝臓細胞表面上の負電荷とを基にしている（６）。このためポリマーは、肝臓のこのような解剖学的及び生化学的な特徴に基づき、薬物を肝臓標的化させる担体として使用されている。肝臓のより特異的な薬物標的化が、肝臓細胞のアシアログリコプロテイン受容体を使用することにより試みられている。アシアログリコプロテイン受容体（ガラクトース受容体）は高密度で肝細胞に存在する。さらに、リガンドがガラクトース受容体に結合すると、リガンド−受容体複合体が内在化し、ガラクトシル化リガンドの細胞取り込みを可能にする（７）。]
[0014] 特許文献１は、肝臓細胞への治療遺伝子の送達及び肝臓細胞における非相同遺伝子の発現のような遺伝子治療に使用することができる、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の組換えベクターを開示している。しかしながら、ＨＢＶベクターは遺伝子をパッケージングする容量が制限されている。]
[0015] しかしながら、今までのところ動物すなわち鳥類、特にヒトにおいて肝臓器官を特異的に標的とし、同時に肝臓に所望の化合物又は薬物を特異的に送達する普遍的な診断、治療及び／又は予防アプローチが存在していない。]
[0016] このため、被験体において、肝臓器官を特異的に標的とし、肝臓に所望の化合物又は薬物を特異的に送達する普遍的な診断、治療及び／又は予防アプローチが必要とされている。]
[0017] さらに、被験体において、肝臓器官を特異的に標的とし、肝臓に所望の化合物又は薬物を特異的に送達し、同時に肝細胞へのＢ型肝炎及びＤ型肝炎ウイルスの侵入を防ぐ普遍的な診断、治療及び／又は予防アプローチは存在していない。]
[0018] さらに、ワクチン接種等のために免疫系を誘発する抗原性エピトープによる肝臓の特異的な標的化が必要とされている。]
先行技術

[0019] 米国特許第７，００１，７６０号明細書]
発明が解決しようとする課題

[0020] したがって本発明は、肝疾患の効果的で特異的に標的化された診断、予防及び／又は治療、並びに肝機能の調節のための手段及び方法を提供することを目的とする。]
課題を解決するための手段

[0021] 本発明によると、この目的はＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを提供することにより解決される。]
[0022] 上記疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは一般式：
［Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ］ＡＯ
を有する。]
[0023] Ｐは上記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり、「ＨＢＶコンセンサス配列」のアミノ酸配列又はその変異体を含む。]
[0024] ＨはＰのＮ末端にあるｐｒｅＳ由来ペプチドＰの上記疎水性修飾であり、アシル化と疎水性部分の付加とから選択され、ｍは少なくとも１である。]
[0025] Ｒは上記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの任意のＣ末端修飾である（すなわちｎは０又は少なくとも１である）。]
[0026] Ａは任意のアンカー基であり（すなわちｏは０又は少なくとも１である）、これは化合物の共有結合に適しており、Ｈ、Ｐ及び／又はＲと連結する。]
[0027] 本発明によると、この目的はさらに、本明細書中に規定のようなＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを少なくとも１つと、少なくとも、本明細書中に規定のような肝臓、好ましくは肝細胞に特異的に送達される化合物と、任意で薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供することにより解決される。]
[0028] 本発明によると、この目的はさらに、肝臓に化合物を特異的に送達するためのビヒクル又はシャトルとしてＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを使用することにより解決される。]
[0029] 本発明によると、この目的はさらに、肝疾患若しくは肝障害の診断、予防及び／又は治療、又は肝機能の調節に関するＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド若しくは本発明の医薬組成物を提供することにより解決される。]
[0030] 本発明によると、この目的はさらに、肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療用の薬剤の製造に関するＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド若しくは本発明の医薬組成物を使用することにより解決される。]
[0031] 本発明によると、この目的はさらに、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は本発明の医薬組成物を利用することによって肝疾患又は肝障害を診断、予防及び／又は治療する方法により解決される。]
[0032] 本発明によると、この目的はさらに、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド及び本明細書中に規定のような化合物又は医薬組成物を含む、本明細書中に規定のような共役体を被験体に投与することによって、肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療と、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶの感染予防とを組み合わせる方法を提供することにより解決される。]
[0033] 本発明によると、この目的はさらに、肝疾患又は肝障害の遺伝子治療に関する本明細書中に規定のようなｐｒｅＳ由来ペプチドＰをコードする核酸を含むウイルスベクターの使用を提供することにより解決される。]
図面の簡単な説明

[0034] ＨＢＶ粒子及びＨＢＶ Ｌ−タンパク質、Ｍ−タンパク質及びＳ−タンパク質のの概略図。Ａ：一部が二本鎖のＤＮＡが、末端タンパク質（ＴＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）及びＲＮａｓｅＨから成るウイルスポリメラーゼ複合体と共有結合する。ゲノムが１２０個のコアタンパク質二量体から構成される２０面体シェルによって封入される。３つのＨＢＶ表面タンパク質、Ｌ−タンパク質、Ｍ−タンパク質及びＳ−タンパク質はＥＲ由来脂質二重層に組み込まれている。Ｌ−タンパク質及びＭ−タンパク質は膜アンカーとして働く完全なＳ−ドメインを含有する。 Ｂ：３つのＨＢＶ表面タンパク質、Ｌ−タンパク質、Ｍ−タンパク質及びＳ−タンパク質のドメイン構造を示している。Ｌ−タンパク質はＮ末端でミリストイル化した１０７個のアミノ酸のｐｒｅＳ１−ドメインと、５５個のアミノ酸のｐｒｅＳ２−ドメインと、４つの膜貫通領域（Ｉ〜ＩＶ）を含有するＳ−ドメインとを含有する。
ＨＢＶ ｐｒｅＳ１コンセンサス配列を示す図である。上部：ｐｒｅＳ１−ドメイン、ｐｒｅＳ２−ドメイン及びＳ−ドメインを有するＨＢＶ Ｌ−タンパク質を示している。Ｎ末端がミリストイル化している。下のアラインメントは、アミノ酸２〜４８を包含する、コンセンサス配列（コンセンサス）、及び８つのＨＢＶ遺伝子型（Ａ〜Ｈ）とウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）とのｐｒｅＳ配列を示している。遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨはそのＮ末端に１１個のさらなるアミノ酸を有しており、遺伝子型ＦはそのＮ末端に１０個のさらなるアミノ酸残基を有していることに留意されたい。下部に、既知の機能的なサブドメインを示している。ＨＢＶ遺伝子型ＣはＨＢＶ遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋを表すことに留意されたい。
皮下適用後のＨＢＶ ｐｒｅＳ由来リポペプチドの生体内分布及び肝臓安定性を表す図である。Ａ：対照のＦｕｚｅｏｎ（登録商標）（Ｔ−２０）と比較した、雄のＮＭＲＩマウスでの皮下注射後のミリストイル化（Ｃ１４）対ステアロイル化（Ｃ１８）のＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８（Ｄ）ペプチドの肝臓特異的な集積を示している。動物１匹当たり約２．２５μｇの１３１Ｉ標識化ペプチドを皮下注射した。指定時点で、動物を屠殺し、肝臓特異的なペプチド集積（％ＩＤ／ｇ）を求めた。 Ｂ：同じペプチドを有するｕＰＡ＋／−／ＲＡＧ−２−／−Ｐｆｐ−／−マウスへの皮下注射の２４時間後に得られた肝臓抽出物（橙色の曲線）と比較した、純粋な１３１Ｉ標識化ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）（茶色の曲線）の逆相ＨＰＬＣを示す。検出可能な活性の５０％が画分１３で溶出していることに留意されたい。疎水性のミリストイル残基がＮ末端に位置しているので、Ｃ末端画分１３でのヨウ素化Ｔｙｒ残基が不変の全長ペプチドを表す。
ＮＭＲＩマウスにおける皮下適用後のＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）の生体内分布を示す図である。各時点当たり、２．２５μｇの１３１Ｉ標識化ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）をＮＭＲＩマウスに皮下注射した（Ｎ＝３）。注射の１０分後、１時間後、４時間後及び２４時間後、動物を屠殺し、器官特異的な（血液、肺、心臓、脾臓、肝臓、腎臓及び筋肉）ペプチド集積（％ＩＤ／ｇ）を求めた。ほとんどのペプチドが肝臓に集積し、Ｙ軸は、他の器官で分布がより良好に消散したためずれてしまっている（jolted）ことに留意されたい。
ｕＰＡ＋／−／ＲＡＧ−２−／−Ｐｆｐ−／−マウスにおける皮下適用後のＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）の生体内分布を示す図である。各時点当たり、２．２５μｇの１３１Ｉ標識化ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）を皮下注射した（Ｎ＝３）。１０分後、１時間後、４時間後及び２４時間後、動物を屠殺し、器官特異的な（肝臓、脾臓、腎臓、血液、肺、腸、心臓、筋肉及び脳）ペプチド集積（％ＩＤ／ｇ）を求めた。ＮＭＲＩマウスのように、ほとんどのペプチドが肝臓に集積することに留意されたい。
マウスにおける皮下注射後の１２５Ｉ標識化ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）のシンチグラムを示す図である。右脚近くへの皮下注射後のマウスの肝臓における１２５Ｉ標識化ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）の特異的な集積を表す。肝臓は中央左側にあると思われる。頭部近くの徐々に強くなっている（upcoming）シグナルは甲状腺であり、ペプチドの脱ヨウ素化後の遊離ヨウ素を表し得ることに留意されたい。
向肝性は配列特異的であり、Ｎ末端の疎水性修飾を必要とすることを表す図である。ランダム化（「スクランブル（scrambled）」）配列と比較した、Ｎ末端が疎水性修飾されていないｐｒｅＳペプチドの生体内分布を示す。ＨＢＶ ｐｒｅＳ／１−４８ Ｔｙｒとそのランダム化形態との両方が腎臓に位置していることに留意されたい。Ａ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／１−４８ Ｔｙｒ（Ｄ）の生体内分布を示す。 Ｂ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／スクランブル１−４８ Ｔｙｒ（Ｄ）の生体内分布を示す。
ランダム化（「スクランブル」）配列と比較した、疎水性修飾されたｐｒｅＳペプチドの生体内分布を示す。ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）だけが肝臓に輸送され、そのランダム化形態は均等に分布している。Ｃ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体内分布を示す。Ｄ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ Ｔｙｒ（スクランブル）ステアロイル（Ｄ）の生体内分布を示す。
疎水性修飾されたｐｒｅＳペプチドの変異体（該変異体はＮ末端及び／又はＣ末端で切断されているか、又は点突然変異されている）の生体内分布を示す図である。切断変異体、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／５−４８ Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−３３−Ｄ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）、及びＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２１ Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）は向肝性を示すが、１２位に点突然変異を有する変異体（Ｇ１２Ｅ）は向肝性を示さない。Ａ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／５−４８ Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体内分布を示す。 Ｂ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−３３−Ｄ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体内分布を示す。
疎水性修飾されたｐｒｅＳペプチドの変異体（該変異体はＮ末端及び／又はＣ末端で切断されているか、又は点突然変異されている）の生体内分布を示す図である。Ｃ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８（Ｇ１２Ｅ） Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体内分布を示す。 Ｄ：マウスにおけるＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２１ Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体内分布を示す。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドによるＨＢＶ感染阻害を表す図である。Ａ：ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／（−１１）−４８ｍｙｒ（Ｃ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）及びＨＢＶ ｐｒｅＳ／（−１１）−４８ステアロイル（Ｃ）によるＨＢＶ感染阻害を表す。ここで、（Ｃ）又は遺伝子型ＣはＨＢＶ遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋを表す。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドによるＨＢＶ感染阻害を表す図である。Ｂ：ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−１５ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２６ステアロイル（Ｄ）及びＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）によるＨＢＶ感染阻害を表す。ＨｅｐａＲＧ細胞を、非存在下（０ｎＭ）又はそれぞれ１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ及び１０００ｎＭの本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドの存在下のいずれかで感染させた。感染性接種材料（遺伝子型ＤのＨＢＶ）とペプチドとを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞をさらに１２日間維持し、ウイルス遺伝子を発現させた。８日目〜１２日目の細胞培養上清を回収し、定量的な市販のＥＬＩＳＡを使用して分泌ＨＢｓＡｇに関して解析した。それぞれの不完全感染によるＨＢｓＡｇ値を１００％とし、感染阻害の程度を不完全感染の％で与える。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドとヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）との結合がミリストイル依存的及び配列特異的であることを表す図である。共焦点画像を示す免疫蛍光青色：ｄａｐｉ、緑色：ＦＩＴＣ。ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）を、４時間４００ｎＭのペプチドを用いて又は用いずにインキュベートした：Ａ ペプチドなしＢ ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣを用いてＣ ｍｕｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣを用いてＤ ｗｔ ｍｙｒ（−）−ＦＩＴＣを用いて。明るい（緑色）ドットは細胞の自己蛍光を示し（Ａ、Ｃ及びＤ）、Ｂだけでペプチドと細胞との結合を見ることができる。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ［配列番号３９］を表す。ｍｕｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｌ１１位及びＦ１３位に２つのアミノ酸置換を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ（該アミノ酸はそれぞれＤアミノ酸残基（Ｄ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｐｈｅ）で置換された）［配列番号４０］を表す。ｗｔ ｍｙｒ（−）−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、ミリストイル化を有しないＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８（Ｃ）−ＦＩＴＣ［配列番号３９］を表す。フルオロフォアＦＩＴＣはさらなるＬｙｓの側鎖（ＮＨ２基）に結合した。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドの結合がＨＢＶ感受性肝細胞に限定されないことを表す図である。共焦点画像を示す免疫蛍光 青色：ｄａｐｉ、緑色：ＦＩＴＣ。細胞を３７℃で４時間、４００ｎＭのペプチドを用いて又は用いずにインキュベートした：Ａ（上部パネル）分化ＨｅｐａＲＧ細胞Ｂ（下部パネル） マウス初代肝細胞（ＰＭＨ）。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣのみが細胞と結合する。明るい（緑色）ドットは細胞の自己蛍光を示す。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、さらなるＬｙｓの側鎖（ＮＨ２基）に結合したフルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ［配列番号３９］を表す。ｍｕｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｌ１１位及びＦ１３位に２つのアミノ酸置換を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ（該アミノ酸はそれぞれＤアミノ酸残基（Ｄ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｐｈｅ）で置換された）［配列番号４０］を表す。ｗｔ ｍｙｒ（−）−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、ミリストイル化を有しないＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８（Ｃ）−ＦＩＴＣ［配列番号３９］を表す。フルオロフォアＦＩＴＣはさらなるＬｙｓの側鎖（ＮＨ２基）に結合した。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドの結合が細胞の分化状態に依存することを表す図である。ペプチドは分化した肝細胞とのみ結合する。共焦点画像を示す免疫蛍光 青色：ｄａｐｉ、緑色：ＦＩＴＣ。細胞を３７℃で４時間、４００ｎＭのペプチドを用いて又は用いずにインキュベートした：Ａ（上部パネル） 分化ＨｅｐａＲＧ細胞と未分化ＨｅｐａＲＧ細胞との比較Ｂ（下部パネル） 分化マウス初代肝細胞（ＰＭＨ）と脱分化マウス初代肝細胞（ＰＭＨ）との比較。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは分化細胞とのみ結合する。明るい（緑色）ドットは細胞の自己蛍光を示す。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ［配列番号３９］を表す。フルオロフォアＦＩＴＣはさらなるＬｙｓの側鎖（ＮＨ２基）に結合した。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドとマウス初代肝細胞（ＰＭＨ）との結合のＦＡＣＳ解析結果を表す図である。Ａ：ＦＡＣＳ解析のプロトコルを示す。
本発明の疎水性修飾されたＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドとマウス初代肝細胞（ＰＭＨ）との結合のＦＡＣＳ解析結果を表す図である。Ｂ：ＦＡＣＳ解析の結果を示す（免疫蛍光結果と比較した）。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣのみが細胞と結合する。ｗｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ［配列番号４１］を表す。ｍｕｔ ｍｙｒ−ＦＩＴＣは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）で標識化された、Ｌ１１位及びＦ１３位に２つのアミノ酸置換を有するＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｃ）−ＦＩＴＣ（該アミノ酸はそれぞれＤアミノ酸残基（Ｄ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｐｈｅ）で置換された）［配列番号４２］を表す。フルオロフォアＦＩＴＣはさらなるＬｙｓの側鎖（ＮＨ２基）に結合した。
ＨＢＶ ｐｒｅＳ由来ペプチドとマウスインターフェロンαとの融合構築物を示す図である。
ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２ｍｙｒ（Ｄ）−ＩＦＮαの精製及び活性試験結果を表す図である。組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の上清からの融合タンパク質、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２０ｍｙｒ（Ｄ）−マウスインターフェロンα２の精製を表す。Ａ 第１のクロマトグラフィー工程：ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２０ｍｙｒ（Ｄ）−ＩＦＮα構築物がＣ末端のＨｉｓ−タグを保有しているため、Ｎｉ−アガロースを使用するＨｉｓ−タグを介するクロマトグラフィー精製。Ｂ 第２のクロマトグラフィー工程：ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓ７５）。Ｃ 第１のクロマトグラフィー工程の溶出画分をＩＦＮに関して試験した。実施例も参照されたい。ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２０（Ｄ）のアミノ酸配列に関しては、配列番号３８を参照されたい。]
[0035] 本発明を以下でより詳細に説明する前に、本発明は、本明細書中に記載の特定の方法、プロトコル及び試薬は様々であり得るため、これらに限定されないことを理解されたい。本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明するためにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されたい。特に規定のない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は全て、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明のために、本明細書中で言及される参考文献は全て、その全体が参照により本明細書中に援用される。]
[0036] ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド
上記で概説されたように、本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを提供する。]
[0037] ＨＢＶのエンベロープは、Ｌ−（大型）タンパク質、Ｍ−（中型）タンパク質及びＳ−（小型）タンパク質と呼ばれる３つのタンパク質を取り囲んでいる（図１Ａを参照されたい）。３つのタンパク質は、４つの膜貫通領域を有するＣ末端のＳ−ドメインを共有する。Ｍ−タンパク質及びＬ−タンパク質は、５５個のアミノ酸のさらなるＮ末端伸長と、遺伝子型に依存した１０７個又は１１８個のアミノ酸とを保有する（ｐｒｅＳ２−及びｐｒｅＳ１）（図１Ｂを参照されたい）。] 図１Ａ 図１Ｂ
[0038] このため、本発明によるＨＢＶの「ｐｒｅＳ由来」ペプチドという表現は、ＨＢＶのＬ−タンパク質のＮ末端伸長、ｐｒｅＳ１に、好ましくはＡ〜Ｈの種及び遺伝子型、並びにウーリーモンキーのＢ型肝炎ウイルス（ＷＭＨＢＶ）、チンパンジー及びゴリラのＢ型肝炎ウイルスのコンセンサス配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを表すが、これはその変異体、好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端で切断された変異体、アミノ酸置換変異体も表す。]
[0039] 配列番号１は、Ａ〜Ｈの種及び遺伝子型、並びにウーリーモンキーのＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）のｐｒｅＳコンセンサスアミノ酸配列を示す。]
[0040] アミノ酸２〜４８を包含する、ＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列（コンセンサス）と、８つのＨＢＶ遺伝子型（Ａ〜Ｈ）及びウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）のｐｒｅＳ配列とを示す図２におけるアラインメントを参照されたい。遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、それらのＮ末端に最大１１個のさらなるアミノ酸を有していることに留意されたい。] 図２
[0041] 本願内のＨＢＶ「遺伝子型Ｃ」のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎｂａｎｋ ＡＢＶ０２８５０．１で示されるＨＢＶ遺伝子型Ｃに対応するか又はこれと同一である、人工の配列を表すが、４６位（以下で記載のナンバリングに従う）が、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ではＧｌｎ（Ｑ）である代わりに、本発明の遺伝子型ＣではＬｙｓ（Ｋ）である。本願のＨＢＶ遺伝子型Ｃの配列は、「ＨＢＶ遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋ」と称することもできる。配列番号４、配列番号１２、配列番号２１〜配列番号２７も参照されたい。]
[0042] 図２は、ＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸残基のナンバリングも示しているが、これは本願を通して以下のものを表している：
アミノ酸残基番号１は遺伝子型Ｄ（以前は亜型ａｙｗと記載される、配列番号５も参照されたい）のメチオニン（Ｍｅｔ１）であるが、アミノ酸残基番号（−１１）は遺伝子型Ｃ（配列番号４）のメチオニン（Ｍｅｔ（−１１））である。ｉｎ ｖｉｖｏでＭｅｔ１又はＭｅｔ（−１１）をそれぞれ、細胞メチオニルアミノペプチダーゼにより切断し、その後Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼによりミリストイル残基をそれぞれ、ミリストイル−ＣｏＡからアミノ酸残基番号２のグリシン（Ｇｌｙ２）又はアミノ酸残基番号（−１０）のグリシン（Ｇｌｙ（−１０））に移動させることにより修飾する。遺伝子型ＤのＮ末端アミノ酸残基が天然アミノ酸グリシン（Ｇｌｙ２）であり、Ｌの基となるオープンリーディングフレームのコドンからのそれぞれのナンバリングに従って２の番号が付けられる（又は例えば遺伝子型ＣではＧｌｙ（−１０））。] 図２
[0043] ＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列は遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのさらなるＮ末端アミノ酸も含む（「−」位で指定される）。このため、全体でＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列は（−１１）位〜４８位を包含する。]
[0044] したがって上記のナンバリングと配列番号１におけるアミノ酸の実際のリストとには違いがある。例えば、
Ｍｅｔ（−１１）、残基番号（−１１）は配列番号１ではアミノ酸残基１として挙げられている。
Ｇｌｙ（−１０）、残基番号（−１０）は配列番号１ではアミノ酸残基２として挙げられている。
Ｍｅｔ１、残基番号１は配列番号１ではアミノ酸残基１２として挙げられている。
Ｇｌｙ２、残基番号２は配列番号１ではアミノ酸残基１３として挙げられている。
Ｇｌｙ４８、残基番号４８は配列番号１ではアミノ酸残基５８として挙げられている。]
[0045] 配列番号１ＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列（（−１１）位〜４８位）
（−１１）−Ｍ ＧＧＷＳＳＴＰＲＫＧ ＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＲＡ ＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮ ＰＮＫＤＨ ＷＰＥＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号２ ＨＢＶ遺伝子型Ａ
（−１１）−Ｍ ＧＧＷＳＳ ＫＰＲＫＧ ＭＧＴＮＬ ＳＶＰＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＧＡ ＮＳＮＮＰ ＤＷＤＦＮＰＶＫＤＤＷＰＡＡＮ ＱＶＧ−４８
配列番号３ ＨＢＶ遺伝子型Ｂ
（−１１）−Ｍ ＧＧＷＳＳ ＫＰＲＫＧ ＭＧＴＮＬ ＳＶＰＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＫＡ ＮＳＥＮＰ ＤＷＤＬＮ ＰＨＫＤＮ ＷＰＤＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号４ ４６位がＧｌｎ（Ｑ）の代わりにＬｙｓ（Ｋ）であること以外はＨＢＶ遺伝子型Ｃに対応する、人工のアミノ酸配列（Ｑ４６Ｋ）
（−１１）−Ｍ ＧＧＷＳＳ ＫＰＲＱＧ ＭＧＴＮＬ ＳＶＰＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＧＡ ＮＳＮＮＰ ＤＷＤＦＮ ＰＮＫＤＨ ＷＰＥＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号５ ＨＢＶ遺伝子型Ｄ
１−ＭＧＱＮＬＳＴＳＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＲＡＮＴＡＮＰ ＤＷＤＦＮ ＰＮＫＤＴ ＷＰＤＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号６ ＨＢＶ遺伝子型Ｅ
（−１０）−ＭＧＬＳＷ ＴＶＰＬＥ ＷＧＫＮＩ ＳＴＴＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＲＡ ＮＴＲＮＰ ＤＷＤＨＮ ＰＮＫＤＨ ＷＴＥＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号７ ＨＢＶ遺伝子型Ｆ
（−１１）−Ｍ ＧＡＰＬＳＴＴＲＲＧ ＭＧＱＮＬ ＳＶＰＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＬＦＲＡ ＮＳＳＳＰ ＤＷＤＦＮ ＴＮＫＤＳ ＷＰＭＡＮＫＶＧ−４８
配列番号８ ＨＢＶ遺伝子型Ｇ
（−１０）−ＭＧＬＳＷ ＴＶＰＬＥ ＷＧＫＮＬＳＡＳＮＰ ＬＧＦＬＰ ＤＨＱＬＤ ＰＡＦＲＡ ＮＴＮＮＰ ＤＷＤＦＮＰＫＫＤＰＷＰＥＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号９ ＨＢＶ遺伝子型Ｈ
（−１１）−Ｍ ＧＡＰＬＳ ＴＡＲＲＧ ＭＧＱＮＬ ＳＶＰＮＰ ＬＧＦＦＰ ＤＨＱＬＤ ＰＬＦＲＡ ＮＳＳＳＰ ＤＷＤＦＮ ＴＮＫＤＮ ＷＰＭＡＮ ＫＶＧ−４８
配列番号１０ ＷＭＨＢＶ
１−ＭＧＬＮＱ ＳＴＦＮＰ ＬＧＦＦＰ ＳＨＱＬＤ ＰＬＦＫＡ ＮＡＧＳＡ ＤＷＤＫＮ ＰＮＫＤＰ ＷＰＱＡＨＤＴＡ−４８]
[0046] 配列番号２〜配列番号１０に関してはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号も参照されたい：
ＨＢＶ遺伝子型Ａ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＴ２８６８４．１
ＨＢＶ遺伝子型Ｂ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＵ０１９５０．１
ＨＢＶ遺伝子型Ｃ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＶ０２８５０．１（４６位はＧｌｎ（Ｑ）（ＡＢＶ０２８５０．１）ではなくＬｙｓ（Ｋ）（配列番号４等）である）
ＨＢＶ遺伝子型Ｄ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＲ１９３３７．１
ＨＢＶ遺伝子型Ｅ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＳ３１１０１．１
ＨＢＶ遺伝子型Ｆ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＫ１９７７４．１
ＨＢＶ遺伝子型Ｇ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＦ３４７３５．１／ＡＦ１６０５０１＿３
ＨＢＶ遺伝子型Ｈ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＭ０９０５２．１
ＷＭＨＢＶ Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ１６９０５．１]
[0047] 本発明によるＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは、式：
［Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ］ＡＯ
（式中、
Ｐが上記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり、
ＨがＰの上記疎水性修飾であり、
ＲがＰのＣ末端修飾であり、
Ａがアンカー基であり、
ｍが少なくとも１であり、
ｎが０又は少なくとも１であり、
ｏが０又は少なくとも１である）を有する。]
[0048] 好ましくは、ｎ及びｏの両方とも０ではない。]
[0049] 本発明によるＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチドＰは、
配列番号１に示されるＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸配列、又は
その変異体、
を含む。]
[0050] 「変異体」は好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端で切断された変異体、アミノ酸置換若しくは欠失変異体、又は伸長（prolonged）変異体である。変異体はさらに、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸若しくはペプチド模倣体、又はペプチド骨格／構造を模倣し得るさらなる化合物を含むアミノ酸配列を含む。]
[0051] 好ましくは、変異体は、配列番号１のＮ末端及び／又はＣ末端で切断された変異体；アミノ酸置換又は欠失変異体；修飾アミノ酸、非天然アミノ酸若しくはペプチド模倣体、又はペプチド骨格／構造を模倣し得るさらなる化合物を含む変異体から選択される。]
[0052] 本発明によれば、疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの変異体は、少なくとも１０個又は２０個の配列番号１の連続したアミノ酸を含有し、配列番号１の１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個若しくはそれ以上のアミノ酸、又はその変異体から成り得る。]
[0053] Ｎ末端及び／又はＣ末端で切断された変異体は好ましくは、配列番号１の少なくとも１４個の連続したアミノ酸（例えば残基５〜１８）、より好ましくは少なくとも１９個の連続したアミノ酸（例えば残基２〜２０）、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸（例えば残基２〜２１）を含む。]
[0054] 「変異体」という用語は、肝炎ウイルス属、例えばＨＢＶ株α１、ＨＢＶ株ＬＳＨ（チンパンジー単離株）、ウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の様々なウイルス種、株若しくは亜型、又はＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｈ、及び本明細書中に規定のようなＨＢＶ遺伝子型Ｃ、Ｑ４６Ｋ（例えば配列番号４）から成る群から選択される株で見られる相同配列も表す。]
[0055] 「変異体」という用語は、配列番号１又は本明細書中で開示の任意の他のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％又は９５％の配列同一性を示す相同配列も表す。]
[0056] したがって、本発明による好ましい疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドでは、Ｐは様々なウイルス種、株若しくは亜型、好ましくはＨＢＶ若しくはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の遺伝子型のアミノ酸配列又はその変異体を有する配列番号１の変異体を含む。]
[0057] 好ましくはＰは配列番号２〜配列番号１０から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む（図２も参照されたい）。] 図２
[0058] 好ましい実施形態において、本発明による疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドでは、Ｐは、配列番号１で示されるＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列の
アミノ酸残基２〜４８［配列番号１１］
アミノ酸残基２〜２０
アミノ酸残基２〜２１［配列番号１２］
アミノ酸残基９〜１５［配列番号２１］
から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の変異体を含む。]
[0059] より好ましくはＰは、残基１７〜２１の欠失等によって配列番号１の残基９〜２２にアミノ酸置換及び／又は欠失を含まない。]
[0060] より好ましくはＰは、配列番号１の残基９〜１５にアミノ酸置換及び／又は欠失を含まない。]
[0061] より好ましくは、配列モチーフＮＰＬＧＦＦＰ（配列番号１の残基９〜１５に対応する）はＤ−アミノ酸による残基１１〜１５の置き換え等によっては遮断又は修飾されない。]
[0062] 本発明者らは、以下で記載のように、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの向肝性に重要なこれらのアミノ酸残基を同定している。]
[0063] より好ましくは、本発明による疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドではＰは、
コンセンサス配列のアミノ酸残基２〜４８［配列番号１１］、
コンセンサス配列のアミノ酸残基２〜２１［配列番号１２］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４８［配列番号１３］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基５〜４８［配列番号１４］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜４８［配列番号１５］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２１［配列番号１６］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基５〜２１［配列番号１７］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜２１［配列番号１８］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜１５［配列番号１９］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基５〜１５［配列番号２０］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１５［配列番号２１］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜４８［配列番号２３］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜４８［配列番号２４］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基９〜４８［配列番号２５］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜２１［配列番号２６］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜２１［配列番号２７］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基９〜２１［配列番号２８］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜２０［配列番号３８］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜１５［配列番号２９］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜１５［配列番号３０］、
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基９〜１５［配列番号２１］
から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の変異体を含む。]
[0064] このため好ましくはＰは、配列番号１１〜配列番号３０及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。]
[0065] 配列番号１の「変異体」は、その配列が好ましくは、１時間後であっても肝臓組織１ｇ当たりの注入用量の１０％を超える向肝性を示していれば、アミノ酸欠失、他のアミノ酸又は同配体（タンパク質アミノ酸との密接した構造的及び空間的な類似性がある修飾アミノ酸）による保存的又は非保存的な置き換えのようなアミノ酸置換、アミノ酸付加又は同配体付加を含む変異体又は「類似体」も含む。]
[0066] 保存的なアミノ酸置換は典型的には、同じ群のアミノ酸間での置換に関する。これらの群としては例えば、
非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシン、
塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン及びヒスチジン、
酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに
非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステインが挙げられる。]
[0067] 好ましくは、本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを、それらの免疫特性を低減するように修飾する。]
[0068] このため、置換及び／又は欠失により修飾されるのに好ましい配列モチーフは、免疫原性に関与する配列、例えばＢ細胞エピトープ及び／又はＴ細胞エピトープである。]
[0069] ＨＢＶのＢ細胞エピトープは好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３、モチーフＤＰＡＦ、並びにコンセンサス配列（配列番号１）及び遺伝子型Ｃ（配列番号４）のアミノ酸残基２６〜３２、モチーフＮＳＮＮＰＤＷ、又は遺伝子型Ｄ（配列番号５）のアミノ酸残基２６〜３２、モチーフＮＴＡＮＰＤＷである。]
[0070] 好ましい実施形態において、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３を好ましくはアミノ酸置換により修飾する、及び／又はアミノ酸残基２６〜３２を好ましくはアミノ酸置換により修飾する。]
[0071] 好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３（モチーフＤＰＡＦ）を、アラニンでのアミノ酸置換により、好ましくはモチーフＡＰＡＦに修飾する。]
[0072] 好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２６〜３２を、アラニンでのアミノ酸置換により、好ましくはモチーフＮＡＮＡＰＤＷ又はＮＡＡＡＰＤＷに修飾する。]
[0073] 置換及び／又は欠失により修飾されるのにさらに好ましい配列モチーフは、抗体認識モチーフである配列である。]
[0074] 好ましくは、免疫原性に関与する配列、例えばＢ細胞エピトープを修飾する目的は、本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの免疫原性を低減することである。当業者は、この目的と、その利点及び不利点とを認識している。重要なことに、本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの免疫原性を低減しながら、所望の肝臓標的化／肝向性の特徴についても検討する必要がある。免疫反応を誘起しないシャトルペプチドは、体液性免疫反応から全身的に取り除くことなく繰り返し投与することができる。]
[0075] このため好ましい実施形態において、Ｐは、肝臓標的化／肝向性を維持するために、配列番号１の残基９〜１５にはアミノ酸置換及び／又は欠失を含まない。]
[0076] 本発明のより好ましい疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは、高い肝臓標的化／肝向性と、低い免疫原性又は非免疫原性とを示す。]
[0077] 好ましい実施形態において、Ｐは、配列番号３１〜配列番号３７から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。]
[0078] 表並びにそれぞれの図面及び実施例も参照されたい。]
[0079] より好ましい実施形態において、Ｐは、
配列番号１１（コンセンサス配列の残基２〜４８）、
配列番号１２（コンセンサス配列の残基２〜２１）、
配列番号１３（遺伝子型Ｃの残基２〜４８）、
配列番号１６（遺伝子型Ｃの残基２〜２１）、
配列番号２３（遺伝子型Ｄの残基２〜４８）、
配列番号２６（遺伝子型Ｄの残基２〜２１）、
配列番号３８（遺伝子型Ｄの残基２〜２０）、及び
配列番号３１（遺伝子型Ｃの残基２〜４８、並びに２１位、２３位、２９位及び３０位でのＡｌａ突然変異）、
から選択されるアミノ酸配列を含む。]
[0080] 上記のものは、以下の所望の特徴の好ましい組合せを満たす、好ましいアミノ酸配列である：短いアミノ酸配列、低い免疫原性又は非免疫原性、及び効率的な肝臓標的化。]
[0081] ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの疎水性修飾（Ｈ）はＰのＮ末端である。]
[0082] 「Ｎ末端」は、Ｎ末端、すなわちそれぞれの最初のアミノ酸残基（例えばＧｌｙ２）での疎水性修飾を表すが、Ｎ末端の近くでの、例えばそれぞれのアミノ酸残基（−４）、（−３）、（−２）、（−１）、１、２又は３又は４での疎水性修飾も含む。このため、疎水性修飾はさらに、ＰのＮ末端に近い部位での疎水性部分の結合により得ることができる。]
[0083] 本発明によるＨＢＶの上記ｐｒｅＳ由来ペプチドの疎水性修飾がペプチドに疎水性部分を付加する。]
[0084] さらに、ｍは少なくとも１、すなわち少なくとも１つの疎水性部分又は疎水性基による修飾である。]
[0085] 本発明の好ましい実施形態において、ｍは、１、２、３、４又はそれ以上である。すなわち、Ｐは２つ以上（例えば２つ）の疎水性部分又は疎水性基で修飾することができる。疎水性部分又は疎水性基は互いに同じであっても又は異なっていてもよい。]
[0086] 本発明によるＨＢＶの上記ｐｒｅＳ由来ペプチドの疎水性修飾は、
アシル化、
疎水性部分の付加、
から選択される。]
[0087] アシル化は好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、脂溶性側鎖を有するアミノ酸によるアシル化から選択される。]
[0088] 好ましい脂肪酸は、好ましくは８個〜２２個の炭素原子を有する（Ｃ８〜Ｃ２２）飽和又は不飽和脂肪酸、分枝又は非分枝脂肪酸である。]
[0089] より好ましくは、アシル化による疎水性修飾は、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）又はステアロイル（Ｃ１８）によるアシル化から選択される。]
[0090] ミリストイル化による修飾は、より安全性が高い、例えばステアロイル基の有害作用（先天性免疫反応等）を示さないためにｉｎ ｖｉｖｏ及び医薬用途に好ましい。]
[0091] 疎水性部分の付加は、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、フェルネソール、脂肪族基、多環芳香族化合物の付加から選択されるのが好ましい。]
[0092] 疎水性部分の結合は共有結合によるのが好ましく、この結合はカルバメート、アミド、エーテル、ジスルフィド、又は当業者の技術内である任意の他の連結を介して達成することができる。]
[0093] このため、本発明の疎水性修飾された、好ましくはアシル化されたｐｒｅＳ由来ペプチドは、Ｎ末端に脂溶性又は疎水性の基／部分があるためリポペプチドであるのが好ましい。]
[0094] 上記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰのＣ末端修飾（Ｒ）は、分解、例えばｉｎ ｖｉｖｏ分解から保護する部分による修飾であるのが好ましい。]
[0095] 「Ｃ末端」は、Ｃ末端、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基での修飾を表すが、Ｃ末端近く、例えば最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目のアミノ酸残基、又はそれ以降のアミノ酸残基での修飾（例えばカルボキシペプチダーゼの作用による酵素分解から担体を保護する１つのＤ−アミノ酸の導入）も含む。]
[0096] 当業者は、それぞれの用途に応じてそれぞれの好適な部分（複数可）を選択することができる。]
[0097] 分解から保護する好ましい部分は、アミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然及び合成ポリマー、例えばＰＥＧ、グリカンから選択される。]
[0098] さらに、ｎは０又は少なくとも１であり、すなわちＣ末端修飾（Ｒ）は任意である。]
[0099] 好ましくは、ｎは１である。]
[0100] 本発明のさらなる実施形態において、ｎは１、２、３、４又はそれ以上である。すなわち、ＰのＣ末端又はその近辺を２つ以上（例えば２つ）の部分又は基で修飾することができる。部分又は基は互いに同じであっても又は異なっていてもよい。]
[0101] 本発明の一実施形態において、Ｈ及び／又はＲはリンカー又はスペーサーを介してＰと連結する。]
[0102] リンカー又はスペーサー、例えばポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、（ＣＨ２）ｎ基は当業者にとって既知である。]
[0103] このため当業者は、それぞれの用途に応じてそれぞれの好適なリンカー（複数可）又はスペーサー（複数可）を選択することができる。]
[0104] アンカー基（Ａ）は化合物、タグ、ラベルに対する結合点として働く。]
[0105] 好ましい実施形態において、アンカー基はＰの「Ｃ末端」であり、ここで「Ｃ末端」はＣ末端、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基での修飾を表すが、Ｃ末端近く、例えば最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目のアミノ酸残基、又はそれ以降のアミノ酸残基での修飾も含む。この場合、ｎは０であってもよく、したがって他のＣ末端修飾Ｒは存在しない。]
[0106] この実施形態において、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の一般式を有し得る：]
[0107] ]
[0108] アンカー基ＡはｐｒｅＳ由来ペプチドＰのアミノ酸側鎖にあり得るか、ｐｒｅＳ由来ペプチドＰのアミノ酸側鎖自体であり得る、すなわちＡは側鎖自体又は修飾側鎖であり得る。]
[0109] アンカー基は、アンカー基として働く、Ｐのアミノ酸配列に導入された修飾アミノ酸残基でもあり得る。]
[0110] 本発明の他の実施形態において、アンカー基Ａは疎水性修飾Ｈ及び／又はＣ末端修飾Ｒと結合する。]
[0111] 好ましくはアンカー基は、エステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択される。]
[0112] 当業者は、結合する、それぞれの化合物、タグ、ラベル等に応じて、それぞれ好適なアンカー基（複数可）を選択することができる。]
[0113] アンカー基はさらに、ビオチン／アビジン、ポリアルギニン／オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）複合体のような複合体形成成分と結合するのに好適であり得る。]
[0114] さらに、ｏは０又は少なくとも１であり、すなわちアンカー基（Ｒ）は任意である。]
[0115] 好ましくは、ｏは１である。]
[0116] 本発明のさらなる実施形態において、ｏは１、２、３、４又はそれ以上である。すなわち、２つ以上（例えば２つ）のアンカー基が存在する。アンカー基は互いに同じであっても又は異なっていてもよく、幾つかの化合物、例えば薬剤及びラベル、又は様々な薬剤の結合を可能にする。]
[0117] 好ましい疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドに関しては、表３及び表４も参照されたい。]
[0118] 本発明のより好ましい疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは以下の通りである：
Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２６、配列番号３１及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を含み、
Ｈは、ステアロイル（Ｃ１８）又はミリストイル（Ｃ１４）によるアシル化での疎水性修飾である。]
[0119] このため、本発明のより好ましい疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは以下の通りである。]
[0120] ]
[0121] 本発明のペプチドは、当業者が容易に知ることができる種々の手法により、一般的に合成化学的手法及び／又は遺伝子工学的手法により調製することができる。]
[0122] より具体的には合成化学的手法としては、固相の逐次及びブロック（block）合成が挙げられる（Erickson and Merrifield, 1976）。固相逐次合成手法を、自動ペプチドシンセサイザーの使用のような確立された自動化法を使用して行うことができる。この手法では、α−アミノ基が保護されたアミノ酸が樹脂支持体に結合する。用いられる樹脂支持体は、（ポリ）ペプチドの固相調製に関する技術分野で従来用いられている任意の好適な樹脂であってもよく、ポリスチレンが好ましくはポリオキシエチレンとコポリマーを形成し、初めに導入されたｏ−アミノ基が保護されたアミノ酸とエステル形成する部位を与える。本発明者らにより適用されたこの最適な方法を明確に説明している（例えば図１２を参照されたい）。アミノ酸を一つずつ（段階的に）導入する。１つのアミノ酸の導入に対応する各合成サイクルには、脱保護工程、連続洗浄工程、アミノ酸の活性化によるカップリング工程、その後の洗浄工程が含まれる。これらの工程のそれぞれの後に濾過が続く。カップリングのための反応試薬（reactive agents）は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアジル−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、及びジフェニルホスホリルアジド等の（ポリ）ペプチド合成のための従来の反応試薬である。樹脂上でのポリペプチド合成後、アニソール、エタンジチオール又は２−メチルインドールの存在下でのトリフルオロ酢酸等の強酸による処理によって、ポリペプチドを樹脂から分離する。それから化合物を従来の精製技法、特にＨＰＬＣによって精製する。] 図１２
[0123] 本発明のペプチドを、選択的に保護される（ポリ）ペプチド断片をカップリングすることにより得ることができ、このカップリングは例えば溶液中で行われる。]
[0124] ペプチドはさらに、当業者にとって既知の遺伝子工学的技法によって作製することができる。真核生物発現系、例えばバキュロウイルス系が特に適している。この手法に従って、異種タンパク質をコードする核酸配列と、調節核酸配列、例えばプロモータとを含有する組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞においてタンパク質を発現させる。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＲＬ １７１１）から入手可能であるＳｆ−９細胞株等の幾つかの細胞株が組換えバキュロウイルスによる感染に利用可能である。また原核生物発現系、例えば大腸菌における発現が特に適している。]
[0125] ペプチドへの疎水性部分の導入を、合成アプローチ及び遺伝子工学的アプローチを含む、当業者が容易に知ることができる種々の手法により達成することができる。]
[0126] 代替的に、ペプチド及び／又は融合ペプチド（すなわち疎水性修飾されたペプチド）は、ＣＨＯ及び当該技術分野で既知であり、ワクチンを生成するのに通常使用される他の細胞株のような安定してトランスフェクトした真核細胞株により作製することができる。Ｎ末端の４７−ｐｒｅＳ１アミノ酸がミリストイル化タンパク質／ペプチドの分泌を促進するという固有の特性のために、生物学的に活性がある、疎水性修飾されたペプチドを細胞培養上清から抽出することができる。]
[0127] 肝臓標的化のためのベクター及びシャトル
上記で概説されたように、本発明は、肝臓に化合物を特異的に送達するためのビヒクル又はシャトルとしてのＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの使用を提供する。]
[0128] 本発明による肝臓に化合物を特異的に送達するための「ビヒクル」又は「シャトル」は、本発明者らにより見出され、本明細書中に記載されるようなＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの向肝性又は向肝性、すなわち肝臓における選択的な集積能、好ましくは肝細胞の細胞膜での選択的な集積能、及び肝細胞への選択的な侵入能を有するものを表す。]
[0129] 本発明は、本発明者らによる、特異性が高い肝臓集積の研究結果と、ＨＢＶのｐｒｅＳ１配列におけるＨＢＶの向肝性の決定因子の同定とに基づいている。したがって本発明は、特異的な肝臓標的化又は送達それぞれのための普遍的なビヒクル又はシャトルの設計のために、向肝性の決定因子に関する知識を利用している。]
[0130] 本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは、肝臓に化合物を特異的に送達させるための汎用ビヒクル又はシャトルである。]
[0131] 好ましくは、肝臓への化合物の特異的な送達は肝細胞への化合物の特異的な送達である。]
[0132] さらに、化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで肝細胞に特異的に送達することができる。]
[0133] 化合物を、動物、好ましくは哺乳類すなわちヒト、又は鳥類の肝臓に特異的に送達するのが好ましい。]
[0134] 送達される化合物
本発明に従って肝臓に特異的に送達される「化合物」は任意の種の化合物であり得る。]
[0135] 好ましい化合物は薬物及び／又はラベルである。]
[0136] 薬物はプロドラッグ又はプレプロドラッグの形態であり得る。]
[0137] 化合物はウイルス又はその誘導体、例えばその表面に標的化配列を露出するように化学的又は遺伝子的に修飾されており、それにより肝細胞を感染させることへと方向転換される複製欠損又は複製可能（replication-competent）組換えウイルス（例えばアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス）でもあり得る。これらのウイルスは肝細胞に特異的な遺伝子送達に適用可能であるものとする。]
[0138] 本発明の好ましい実施形態において、肝細胞に特異的に送達される化合物は薬物（又はプロドラッグ形態の薬物）であり、以下のものから選択されるのが好ましい。]
[0139] ]
[0140] 化合物は臨床的に認可された薬物から選択されるのが好ましい。]
[0141] 一実施形態において、送達される化合物はＩＦＮ−αである。このような実施形態で使用される疎水性修飾されたｐｒｅＳ１由来ペプチドは、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２０ｍｙｒ（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−２０ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶ ｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）であり得る（図１４も参照されたい）。マウスインターフェロン−αとの融合タンパク質又は構築物を、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞における組換え発現によって得た。図１４及び図１５、並びに実施例も参照されたい。] 図１４ 図１５
[0142] 本発明の好ましい実施形態において、肝細胞に特異的に送達される化合物はラベルであり、蛍光色素、放射性同位体及び造影剤から選択されるのが好ましい。]
[0143] 好ましい放射性同位体は１３１Ｉ、１２５Ｉ、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１７７Ｌｕである。]
[0144] 好ましい蛍光色素はＡｌｅｘａ色素、ローダミン及びフルオレセインの誘導体、Ｃｙ−色素、ＦＩＴＣである。]
[0145] 好ましい造影剤は、ガドリニウム（Ｇｄ）錯体、超磁性（supramagnetic）鉄（Ｆｅ）錯体及び粒子、原子番号が高い原子を含有する化合物、すなわちコンピューター断層撮影法（ＣＴ）用のヨウ素、微小気泡、及びこれらの造影剤を含有するリポソーム等の担体である。]
[0146] 本発明のさらに好ましい実施形態において、化合物は同様に標識化される、すなわち本明細書中に規定のようにラベルを保有する。]
[0147] 好ましい実施形態において、化合物はデポー剤又は担体の形態であり、この化合物は例えば、薬物、プロドラッグ又はラベルを保有する。このようなデポー剤又は担体、例えばナノ粒子、リポソーム、微小気泡、ガスエマルションは当該技術分野で既知である。]
[0148] 本発明の他の実施形態において、肝臓に送達される化合物は免疫原性エピトープから選択される。好ましい免疫原性エピトープは肝臓に送達される場合に、肝臓指向性の免疫反応を活性化するため、肝細胞媒介性の抗原提示に役立つ。]
[0149] 好ましい実施形態において、化合物と、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドとが共役体を形成する。]
[0150] 好ましくは、化合物と疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドとの共役体は、共有結合又は複合体形成によって形成される。]
[0151] 好ましくは共役体において、化合物は、好ましくは化合物とアンカー基Ａとを結合することによって、疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと共有結合する。結合の形態は化合物の種類によって変わる。当業者は好適な共役体を形成するのに適したアンカー基を決定することができる。]
[0152] 好ましくは、Ａはさらにスペーサー又はリンカーを含む。]
[0153] スペーサー又はリンカーは、肝細胞に特異的な活性化に関する認識部位を含むのが好ましく、この認識部位は肝タンパク質によって認識されるのが好ましい。]
[0154] 認識部位はタンパク質分解的な切断部位であるのが好ましい。このため、肝タンパク質は好ましくは肝細胞タンパク質、より好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素である。このようにして、切断されることなく、共役体を被験体に投与することができ、身体全体に、例えば体液を通して輸送させる。しかしながら、共役体がその標的、肝臓又は肝細胞それぞれに達するとすぐに、肝タンパク質、例えば肝細胞タンパク質分解酵素はタンパク質分解的な切断部位を切断し、そのシャトル、すなわち疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドから化合物を放出する。]
[0155] さらに好ましい肝タンパク質はシトクロム、例えばシトクロムＰ４５０である。Ａｄｅｆｏｖｉｒ又はＰｒａｄｅｖｏｆｉｒで使用されるような（Metabasis Technologies, Inc.の）ＨｅｐＤｉｒｅｃｔ（登録商標）技術も本発明に適している。]
[0156] 一実施形態において、化合物と疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドとの共役体が複合体形成によって形成される。本発明に有用な好ましい複合体は、ビオチン／アビジン、ポリアルギニン／オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）である。当業者は、好適な複合体成分を決定すること、並びにしたがって化合物及び疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを設計することができる。]
[0157] 疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド、特に本発明の共役体は、肝臓で化合物を濃縮するのに使用される、すなわち肝臓にシャトルする（shuttled）のが好ましい。]
[0158] 好ましくは、化合物を、特に肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏで肝タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素によって、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドとの共役体から切断する。]
[0159] 肝疾患の診断、予防及び／又は治療
本発明の好ましい実施形態において、上記の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド、特に化合物とのそれらの共役体は、肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療のために与えられる。]
[0160] 診断、予防及び／又は治療される肝疾患又は肝障害に応じて、それぞれの化合物を選択し、肝臓へと選択的、特異的に送達する。]
[0161] 本発明による「肝疾患」又は「肝障害」は、肝臓器官、肝臓組織又は肝細胞に影響を与える、又はこれらに関与する任意の疾患又は障害を表す。]
[0162] 肝疾患の例は、
肝炎：主に様々なウイルスにより引き起こされるが、或る特定の毒、自己免疫又は遺伝性疾患によっても引き起こされる肝臓の炎症、
肝硬変：死滅肝臓細胞を置き換える、肝臓における線維組織の形成（肝臓細胞の死滅は、例えばウイルス性肝炎、アルコール依存症又は他の肝毒性の化学物質への接触により引き起こされ得る）、
ヘモクロマトーシス：身体において鉄の集積を引き起こし、最終的には肝臓損傷をもたらす遺伝性疾患、
肝臓の癌：通常胃腸管の他の部分に由来する、原発性の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）又は胆管癌腫及び転移性癌、
ウィルソン病：銅が身体に保持される遺伝性疾患、
原発性硬化性胆管炎：事実上自己免疫性である胆汁管の炎症性疾患、
原発性胆汁性肝硬変：細胆汁管の自己免疫疾患、
バッド・キアリ症候群：肝静脈の閉塞、
ジルベール症候群：集団の約５％に見られるビリルビン代謝の遺伝障害、
ＩＩ型糖原病：全身の進行性の筋力低下（ミオパシー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓及び神経系で様々な身体組織に影響を与えるグリコーゲンの蓄積、
小児肝疾患、例えば胆道閉鎖症、α−１−抗トリプシン欠乏症、アラジール症候群及び進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、
代謝性疾患、
である。]
[0163] さらに、動物、例えばペット又は家畜の肝疾患、特にヒトに伝播する可能性がある疾患、例えばトキソプラズマ症も含まれる。]
[0164] 診断、予防及び／又は治療される肝疾患又は肝障害は、肝炎、肝硬変、ヘモクロマトーシス、好ましくはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型及びＨ型の肝炎ウイルスによって引き起こされる肝炎から選択されるのが好ましい。]
[0165] 診断、予防及び／又は治療される肝疾患又は肝障害は、ウイルス、例えばヘルペスウイルス科のウイルス、例えばヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により引き起こされるが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、コクサッキーウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルスによっても引き起こされる併合肝炎でもあり得る。]
[0166] 診断、予防及び／又は治療される肝疾患又は肝障害は、多くの熱帯病等において肝臓段階（stadium）のウイルス又は非ウイルス病原体を伴う疾患でもあり得る。肝臓段階の幾つかの病原体は初期段階であるので、それぞれの感染をこのような初期段階で選択的、特異的に治療することができる。]
[0167] このようなウイルスはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型及びＨ型の肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスである。]
[0168] このような非ウイルス病原体は細菌、寄生生物及び／又は蠕虫である。]
[0169] 寄生生物は例えば、マラリアを引き起こすプラスモジウム（Plasmodium）属の寄生原生動物、例えば熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、及び関連種（例えば卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫）である。]
[0170] このような蠕虫は例えば、住血吸虫症又はビルハルツ住血吸虫症を引き起こすシストソーマ（Schistosoma）属の扁形動物、例えばマンソン住血吸虫（Schistosomamansoni）、インターカラタム住血吸虫（Schistosoma intercalatum）、ヘマトビウム住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosomajaponicum）及びメコン住血吸虫（Schistosoma mekongi）である。]
[0171] このような寄生生物は例えば、リーシュマニア症の疾患に関与するサンショウバエ（Phlebotomus）属及びルツォミヤ（Lutzomyia）属のリーシュマニアトリパノソーマ（Leishmania trypanosome）原生生物でもある。]
[0172] したがって、マラリア、住血吸虫症（ビルハルツ住血吸虫症）、及び／又はリーシュマニア症を、本発明によって診断、予防及び／又は治療することができる。]
[0173] したがって、或る特定の熱帯病を、本発明によって診断、予防及び／又は治療することができる。]
[0174] 診断、予防及び／又は治療される肝疾患又は肝障害は肝腫瘍、好ましくは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）であるのが好ましい。]
[0175] 診断、予防及び／又は治療される肝疾患又は肝障害は、代謝性疾患、例えば糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、及び肥満、慢性高血糖、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）でもあり得る（（９）も参照されたい）。]
[0176] 本発明の好ましい実施形態において、上記の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド、特に化合物とのそれらの共役体は、肝機能の調節のために与えられる。]
[0177] 肝細胞媒介性の抗原提示及び肝臓指向性の免疫反応の活性化のためにこれらを使用することが好ましい。この場合、肝臓に送達される化合物は免疫原性エピトープであるのが好ましい。]
[0178] 本発明の好ましい実施形態において、上記の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド、特に化合物とのそれらの共役体は、Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染予防にも適している。これは、肝臓を標的とする（向肝性）だけでなく、さらにＨＢＶ及び／又はＨＤＶのウイルス侵入阻害剤として作用するという上記の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの特性のために可能となる。このことは例えば図９に見ることができる。このため、上記の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドは好適なＨＢＶ及び／又はＨＤＶワクチンである（同じ日に出願された、「Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド、並びにＨＢＶ及びＨＤＶ侵入阻害剤としてのそれらの使用（Hydrophobic modified preS-derived peptides of hepatitis B virus （HBV） and their use as HBV and HDV entryinhibitors）」という表題の本発明者らの対応するＰＣＴ特許出願も参照されたい）。]
[0179] したがって、上記のアシル化されたｐｒｅＳ由来ペプチド、特に化合物とのそれらの共役体は、肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療とＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染予防との組合せのために提供することができる。]
[0180] 本発明の好ましい実施形態において、上記のアシル化されたｐｒｅＳ由来ペプチド、特に化合物とのそれらの共役体は、肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療用の薬剤の製造に使用することができる。]
[0181] 医薬組成物
上記で概説されたように、本発明は、本明細書中に規定のようなＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを少なくとも１つと、少なくとも、本明細書中に規定のような肝臓に特異的に送達される化合物と、任意で薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。]
[0182] 本発明による医薬組成物は、
本明細書中の上記で規定のようなＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを少なくとも１つ、
少なくとも、本明細書中の上記で規定のような肝臓、好ましくは肝細胞に特異的に送達される化合物、又は
本明細書中に規定のような共役体、並びに
任意で薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤、
を含む。]
[0183] 本発明による医薬組成物は本明細書中に記載の全ての使用及び方法に非常に適している。]
[0184] 「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」は任意のビヒクルを表し、その中で又はこれを用いて、本発明による医薬組成物又はワクチン組成物が配合され得る。この用語にはリン酸緩衝生理食塩水等の生理食塩溶液が含まれる。一般に、希釈剤又は担体を投与形態及び投与経路、並びに標準的な薬務に基づき選択する。]
[0185] 治療法
さらに上記で概説されたように、本発明は、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は本発明の医薬組成物を利用することにより、肝疾患又は肝障害を診断、予防及び／又は治療する方法を提供する。]
[0186] 本発明は、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド及び化合物を含む本明細書中に規定のような共役体又は本明細書中に規定のような医薬組成物を被験体に投与することにより肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療とＨＢＶ及び／又はＨＤＶの感染予防とを組み合わせる方法も提供する。]
[0187] 本発明による肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療とＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染予防とを組み合わせる方法は、治療的に効果的な量で、被験体に
（ａ）本明細書中の上記で規定のような疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと、少なくとも本明細書中の上記で規定のような化合物とを含む共役体（該共役体は本明細書中の上記で規定のようなものである）、又は
（ｂ）本明細書中の上記で規定のような医薬組成物、
を投与することを含む。]
[0188] 投与経路
好ましくは、特に治療方法における本発明の共役体又は医薬組成物の投与経路を皮下、静脈内、経口、鼻腔、筋肉内、経皮、吸入、坐薬によるものから選択する。]
[0189] 鼻腔投与又は鼻腔塗布に関する好ましい実施形態は鼻腔スプレーである。]
[0190] 治療的に効果的な量
本発明の共役体又は医薬組成物の「治療的に効果的な量」は、各肝疾患又は肝障害を診断、予防及び／又は治療するのに、及び／又はＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染を予防するのに十分な量を表す。]
[0191] 好ましい治療的に効果的な量は体重１ｋｇ当たり１０μｇ〜１ｍｇの範囲内である。]
[0192] ワクチンとしての本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの使用に関して、好ましい治療的に効果的な量は体重１ｋｇ当たり１０μｇ〜１ｍｇの範囲内である。使用される疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドのＩＣ５０値が約１０ｎＭである場合、好ましい治療的に効果的な量は体重１ｋｇ当たり約１００μｇであるか、又は患者１人当たり１ｍｇ〜５ｍｇの範囲内である。]
[0193] 好ましい治療的に効果的な量は、送達されるそれぞれの化合物とそのそれぞれの治療的に効果的な量によって変わる。]
[0194] 当業者は好適な治療的に効果的な量を決定することができる。]
[0195] 遺伝子治療用途
本発明は、遺伝子治療アプローチにおいてｐｒｅＳ由来ペプチド、すなわちｐｒｅＳ由来ペプチドをコードする核酸も提供する。]
[0196] 肝疾患又は肝障害の遺伝子治療のために、本明細書中の上記で規定のようなｐｒｅＳ由来ペプチドＰをコードする核酸を含むウイルスベクターが提供される。核酸はｐｒｅＳ由来ペプチドＰのアミノ酸配列をコードし、この核酸が肝臓標的化を達成するのに必要且つ十分である。]
[0197] 好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである。]
[0198] 一実施形態において、ウイルスベクターは肝臓で発現する非相同配列をさらに含む。]
[0199] ウイルスベクターは好ましくは、遺伝子治療的に好適なベクターであり、当業者にとって既知である。]
[0200] ＨＢＶ受容体の同定
本発明はさらに、ＨＢＶの結合及び／又は浸透に関与する肝細胞受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで同定する、及び／又は上記受容体の発現を定量化する方法であって、上記のような疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを使用することを含む、方法に関する。]
[0201] 上記肝細胞受容体を哺乳類又はそれぞれの動物モデル、好ましくはマウス又はヒトで同定することができる。]
[0202] 特に上記方法は、
上記ペプチドと肝細胞の表面で発現した受容体との特異的な結合を可能にする条件下で、及び可能にするのに十分な期間、肝生検又は肝細胞を本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドに接触させる工程と、
上記ペプチドと受容体との結合を検出する工程と、
上記受容体を同定する工程と、
を含む。]
[0203] ＨＢＶ受容体を同定する方法は、
（ａ）本明細書中に規定のような疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと、少なくとも、本明細書中に規定のような化合物とを含む共役体（該共役体は本明細書中に規定のようなものである）、又は
（ｂ）本明細書中に規定のような医薬組成物、
の使用を含む。]
[0204] これは当業者に既知の従来手法に従って達成することができる。例えば、これは本発明の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの放射性、酵素又は蛍光標識化と、その後の適切な方法による検出とを伴い得る。多くの蛍光材料が既知であり、ラベルとして利用することができる。これらの蛍光材料としては例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッドが挙げられる。酵素ラベルは酵素と対象の分子、例えばポリペプチドとの共役を含み、比色法、分光光度法又は蛍光分光光度法のいずれかにより検出することができる。]
[0205] ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は肝細胞癌腫の最も重要な病因因子である。ＨＢＶ感染の特質は注目すべきｉｎ ｖｉｖｏ有効性及び顕著な向肝性である。顕著な向肝性は、循環系における３つのＨＢＶ表面タンパク質の内の１つと、肝臓関連受容体又は肝臓標的化因子との特異的な相互作用の結果であると考えられる。]
[0206] ＨＢＶ侵入経路の分子詳細と肝細胞結合及び向肝性に関与するＨＢＶ表面タンパク質ドメインの同定とに対する最近の見識に基づき、本発明により、肝疾患、例えばＨＣＣを標的とする、及び任意でＨＢＶ及びＨＤＶ感染に干渉する、新たな群のペプチド−薬物共役体が開発された。]
[0207] 本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＨＢＶ侵入を効果的に阻止するＨＢＶ−ｐｒｅＳ１表面タンパク質由来リポペプチドを同定した。これらの阻害ペプチドに対する本発明の生体内分布試験により、これらの阻害ペプチドが肝臓（これらの阻害ペプチドが肝細胞と結合し、肝細胞に侵入すると推測される）に選択的に集積されることが明らかになった。この向肝性は、ペプチドのＮ末端アシル化を必要とし、Ｎ末端の４７個のｐｒｅＳ１アミノ酸内、すなわちアミノ酸残基２〜２１又はアミノ酸残基２〜２０（又は好ましくは残基９〜１５の最小配列）内の或る特定のＨＢＶ ｐｒｅＳ−配列モチーフによって変わる。このペプチド配列が細胞膜を通るさらに完全な融合タンパク質の輸送を容易にする膜転位シグナルをさらに保有するという本発明者らの観察結果（非公開結果）により、肝細胞の細胞膜に又はさらには選択的にこの細胞に任意の種の薬物が特異的に送達される可能性が開かれる。]
[0208] 本発明者らは、ＨＢＶｐｒｅＳ１由来リポペプチドが非常に低い用量で、移植されるｕＰＡ−ＲＡＧ−１マウスモデルにおいて完全にＨＢＶ感染を防ぐことが可能であることを示している。これらのＨＢＶ ｐｒｅＳ由来の侵入阻害剤に対する薬物動態試験により、極めて高い血清安定性（ｔ１／２ 約６０時間）及び標的器官での長い半減期（ｔ１／２ 約２４時間）と合わせて注目すべき向肝性が示された。Ｎ末端アシル化とペプチドの或る特定のアミノ酸配列の完全性との両方が必須である（すなわちアミノ酸残基２〜２１（又は好ましくは残基９〜１５の最小配列）内での）。ペプチドを、肝細胞の感染を抑えるため又は肝細胞癌腫を治療するため、肝臓特異的な薬物標的化のための汎用ベクターとして使用することができる。]
[0209] 本発明者らはさらに、ＷＭＨＢＶ感染をｉｎ ｖｉｖｏでのＨＢＶエンベロープタンパク質由来ペプチドの皮下適用によって効果的に阻止することができるという原理を証明している。このことにより、急性ＨＢＶ感染の予防と慢性Ｂ型肝炎に対する治療オプションとに関する見通しが開かれる。使用されるｕＰＡ／ＲＡＧ−２／ＰｆｐマウスはＢ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を欠いているので、感受性（susceptible：感染しやすい）肝細胞に対するペプチドの直接的な阻害効果が推測される。このことは、肝臓におけるアシル化されたｐｒｅＳ由来ペプチドの効果的な集積、その後の胆汁経路を介することもある緩徐な除去によって支持される。両方の特性が、非常に低い用量及び低い頻度での皮下適用を可能にする。５日以内の０．２ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ／ｐｒｅＳ２−４８ｍｙｒの５回の注射がＷＭＨＢＶ感染確立の予防をもたらした場合、約３０倍のより活性の高いペプチドＨＢＶ／ｐｒｅＳ２−４８ステアロイルの連続投与は、毎日又は２日ごとに投与すれば、７μｇ／ｋｇ≒１３ｎｍｏｌ／ｋｇ未満の用量であっても効果的であり得る。マウスで得られた体重当たりの有効薬理用量をヒト（８）では約１０倍に補正する必要があることを考慮すると、１人当たりの有効用量は１００μｇ／日未満になると予測される。]
[0210] 本発明者らは、
本発明のＨＢＶｐｒｅＳ１由来リポペプチドがヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）と結合すること、並びにこの結合がミリストイル依存的及び配列特異的であること（図１０も参照されたい）、
本発明のＨＢＶ ｐｒｅＳ１由来リポペプチドの結合がＨＢＶ感受性肝細胞に限定されないこと（図１１も参照されたい）、
本発明のＨＢＶ ｐｒｅＳ１由来リポペプチドの結合が細胞の分化状態に依存すること、及び本発明のＨＢＶ ｐｒｅＳ１由来リポペプチドは分化した肝細胞とだけ結合すること（図１２を参照されたい）、
本発明のＨＢＶ ｐｒｅＳ１由来リポペプチドが他の肝臓癌及び非肝臓癌細胞株とは結合しないこと（Ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｈｅｐ Ｇ２．２１５細胞、ＨｕＨ７細胞およびＣＨＯ Ｋ１細胞との結合は見られなかった（データ図示せず））、
も示している。] 図１０ 図１１ 図１２
[0211] したがって、ペプチドによって扱われる（adressed）細胞因子は分化状態に依存する。しかしこれらはウイルスの宿主域の制限には重要ではない。]
[0212] ]
[0213] ]
[0214] 以下の実施例及び図面は本発明を例示するが、これらに限定されない。]
[0215] 疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの合成
合成を例えば（１０）で記載のように行った。]
[0216] 疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの生体内分布
疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの生体内分布を雄のＮＭＲＩマウスで研究した。全ての実験をドイツの法律に準拠して行った。Ｃ末端にさらなるＴｙｒ残基を含有するペプチドをクロラミン−Ｔ法により１３１Ｉ（Amersham Biosciences, Freiburg, Germany）を用いて標識化し、ＨＰＬＣによって精製した。標識化ペプチドを５０％ＤＭＳＯの溶液の注射により皮下投与した。選択された時間でマウスを屠殺し、血液、心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉及び脳に含有される放射能をγ−カウンター（Canberra Packard, Ruesselsheim, Germany）で測定し、組織１ｇ当たりの注射用量の百分率（％ＩＤ／ｇ）で表した。]
[0217] 肝臓から抽出した後の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの安定性評価
肝臓におけるペプチド安定性を求めるために、１３１Ｉ標識化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ（Ｄ）を皮下注射の２４時間後に１つの肝葉から抽出した。このために、凍結肝臓組織１ｇ当たり１ｍｌの水を試料に添加した。均質化の後、等量のアセトニトリルを添加し、均質化を繰り返した。遠心分離の後（４０００×ｇで２×１０分）、この溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に分離し、それぞれの画分の放射能をγカウンターで定量化した。]
[0218] 細胞株及び初代細胞培養物
ＨｅｐａＲＧ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌのインスリン及び５×１０−５Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシネート（１０）が添加されたウィリアムＥ培地中で成長させた。細胞をトリプシン処理によって２週間ごとに５分の１継代させた。感染２〜３週間前に、２％ＤＭＳＯを維持培地に添加することにより細胞の分化を誘導した。培地を２〜３日ごとに交換した。]
[0219] 感染競合アッセイ
供給に制限がなく、品質が一定になるため、感染性接種材料として、ＨｅｐＧ２クローン２．２．１５（１１）細胞の５０倍濃度の培養上清を使用した。この上清を、６％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００の存在下でウイルス粒子を沈殿させることにより新たに回収した上清から調製した。この沈殿物を、２５％ＦＣＳを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。アリコートを−８０℃で保存した。分化ＨｅｐａＲＧ細胞又はＰＨＨを３７℃で２０時間、４％ ＰＥＧ８０００（Sigma）が添加された培養培地中で１０倍希釈した濃縮感染源と共にインキュベートした。インキュベート終了時に、細胞を培養培地で３回洗浄し、２％ＤＭＳＯ及び５×１０−５Ｍのヒドロコルチゾンヘミスクシネートの存在下で維持し、指定時間で採取した。]
[0220] 競合実験を１２ウェルプレートで行った。初めにおよそ１×１０６個の細胞を化学的に合成されたＨＢＶ由来ペプチドと共に３０分間プレインキュベートした後、２０時間細胞をペプチド及びウイルスと共に同時インキュベートした。全ての競合シリーズを少なくとも２回行い、１つの代表的な実験結果をそれぞれの場合で示している（図３〜図７を参照されたい）。] 図１０ 図１１ 図１２ 図１３-１ 図１３-２ 図１４ 図１５ 図３ 図４ 図５
[0221] ＨｅｐａＲＧ細胞を、非存在下（０ｎＭ）又はそれぞれ１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ及び２０００ｎＭの本発明のペプチドの存在下のいずれかで感染させた。感染性接種材料（遺伝子型ＤのＨＢＶ）とペプチドとを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞をさらに１２日間維持し、ウイルス遺伝子を発現させた。８日目〜１２日目の細胞培養上清を回収し、定量的な市販のＥＬＩＳＡを使用して分泌ＨＢｓＡｇに関して解析した。それぞれの不完全感染によるＨＢｓＡｇ値を１００％とし、感染阻害の程度を不完全感染の％で与える。]
[0222] 免疫蛍光実験／顕微鏡検査
カバーガラス上で成長させた初代肝細胞を、血清無含有細胞培養培地中で２００ｎＭのそれぞれのペプチドと共にインキュベートした。３７℃での１時間のインキュベーション後、細胞を固定し、核をＤＡＰＩで染色した。蛍光顕微鏡検査をＳｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにおいて６００倍の倍率で行った。]
[0223] ＦＡＣＳ解析
冷凍保存された初代肝細胞を解凍し、血清無含有培地で洗浄した。それぞれの反応で、４×１０５細胞／ｍｌを血清無含有細胞培養培地中で２００ｎＭの濃度のそれぞれのペプチドと共にインキュベートした。頻繁に混合しながら、染色を室温で３０分間行った。続いて、細胞を広範囲にわたって洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁して、ＦＡＣＳ解析を進めた。]
[0224] 結果を図面に示す。]
[0225] ＨＢＶｐｒｅＳ１−ペプチドとマウスインターフェロンαとの融合構築物−製造、精製及び活性試験
ＨＢＶ ｐｒｅＳ１−ペプチドとマウスインターフェロンαとの融合タンパク質（図１４を参照されたい）を、バキュロウイルス発現系を使用してＨｉ５昆虫細胞で発現させた。細胞上清中で分泌された融合タンパク質を感染の５日後に採取し、ｐｒｅＳ１−インターフェロンとＣ末端で融合したＨｉｓ−タグに関して、アフィニティクロマトグラフィーにより第１の工程で精製した。溶出画分中のｐｒｅＳ１−インターフェロンタンパク質の活性を、それらのニューカッスル疾患のウイルス媒介性の細胞死を阻害する能力により測定した。機能的なｐｒｅＳ１−インターフェロンタンパク質を含有する溶出画分を、１Ｍの尿素−ＰＢＳ緩衝液を有するＳ７５−セファロースカラムでのゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製した（図１５を参照されたい）。] 図１４ 図１５
[0226] 上記の記載、添付の特許請求の範囲及び／又は添付の図面で開示された特徴は別々で及びそれらを任意で組み合わせて、多様な形態で本発明を実現する上で重要であり得る。]
実施例

[0227] 参考文献
1. Seeger, C. & Mason, W.S. Hepatitis Bvirus biology. Microbiol Mol Biol Rev 64, 51- 68 （2000）.
2. Nassal, M. Hepatitis B virusmorphogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 214, 297- 337 （1996）.
3. Gripon, P., Le Seyec, J., Rumin, S.& Guguen-Guillouzo, C. Myristylation of the hepatitis B virus large surfaceprotein is essential for viral infectivity. Virology 213, 292- 299 （1995）.
4. Le Seyec, J., Chouteau, P., Cannie, I.,Guguen-Guillouzo, C. & Gripon, P. Infection process of the hepatitis Bvirus dependson the presence of a defined sequence in the preS1 domain. JVirol 73, 2052-2057 （1999）.
5. Juliano RL （1988） Factors affecting the clearance kineticsand tissue distribution of liposomes, microspheres, and emulsions. Adv DrugDeliv Rev 2: 31 -54.
6. Hashida M and Takakura Y （1994） Pharmacokinetics in design of polymericdrug delivery systems. J Control Release 31: 163-171.
7. Lu, X. M., Fischman, A. J., Jyawook, S.L., Hendricks, K., Tompkins, R.G. and Yarmush, M. L. （1994） Antisense DNA delivery in vivo: liver targetingby receptor- mediated uptake. J. Nucl. Med. 35, 269-275.
8. Freireich, E.J., Gehan, E.A., Rall,D.P., Schmidt, L.H. & Skipper, H.E. Quantitative comparison of toxicity ofanticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey, and man. Cancer ChemotherRep 50, 219-244 （1966）.
9. Erion, M.D. Prodrugs for liver-targeteddrug delivery. 541-572. Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. Volume V, PartII, Prodrugs. Springer New York, 2007.
10. Gripon, P., Cannie, I. & Urban, S.Efficient inhibition of hepatitis B virus infection by acylated peptidesderived from the large viral surface protein. J Virol 79, 1613-1622 （2005）.
11. Glebe D, Urban S, KnoopEV, Cag N,Krass P, Grun S, Bulavaite A, Sasnauskas K, Gerlich WH. Mappingof thehepatitis B virus attachment site by use of infection- inhibiting preSllipopeptides and tupaia hepatocytes. Gastroenterology 129, 234-245 （2005）.]

权利要求:

請求項1
式：［Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ］ＡＯのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドであって、式中、Ｐは、配列番号１に示されるＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列からなるアミノ酸又はその変異体を含む、前記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり、ここで変異体は好ましくは、配列番号１の少なくとも１４個の連続したアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端で切断された変異体；アミノ酸の置換又は欠失変異体；修飾アミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体を含む変異体から選択され、ＨはＰのＮ末端にある該ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの前記疎水性修飾であり、好ましくはカルボン酸、脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２２の脂肪酸、脂溶性の側鎖を有するアミノ酸によるアシル化と、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、フェルネソール、脂肪族基、多環芳香族化合物から選択される疎水性部分の付加とから選択され、ｍは少なくとも１であり、Ｒは前記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰのＣ末端修飾であり、これは好ましくはアミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然及び合成ポリマー、例えばＰＥＧ、グリカンから選択される、分解から保護する部分であり、ｎは０又は少なくとも１であり、Ａは好ましくは、エステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択されるアンカー基であり、ｏは０又は少なくとも１である、疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項2
Ｈがミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）又はステアロイル（Ｃ１８）によるアシル化から選択されるアシル化による疎水性修飾である、請求項１に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項3
Ｈ及び／又はＲがリンカー又はスペーサーを介してＰと連結する、請求項１又は２に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項4
Ｐが配列番号１の少なくとも２０個の連続したアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端で切断された変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項5
Ｐが配列番号１に示されるＨＢＶｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸残基２〜４８、残基２〜２１、残基２〜２０又は残基９〜１５から選択されるアミノ酸からなる配列番号１の変異体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項6
Ｐが配列番号１の残基９〜１５に、好ましくは配列番号１の残基９〜２２にはアミノ酸置換及び／又は欠失を含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項7
Ｐが様々なウイルス種、株若しくは亜型、好ましくはＨＢＶ若しくはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の遺伝子型のアミノ酸又はその変異体からなる配列番号１の変異体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項8
Ｐが配列番号２〜配列番号１０から選択されるアミノ酸又はその変異体を含む、請求項７に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項9
Ｐが配列番号１１〜配列番号３０及び配列番号３８から選択されるアミノ酸又はその変異体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項10
配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３が好ましくはアミノ酸置換により修飾され、及び／又はアミノ酸残基２６〜３２が好ましくはアミノ酸置換により修飾される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項11
配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３がアラニンのアミノ酸置換により、好ましくはＡＰＡＦモチーフへと修飾される、請求項１０に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項12
配列番号１のアミノ酸残基２６〜３２がアラニンのアミノ酸置換により、好ましくはＮＡＮＡＰＤＷ又はＮＡＡＡＰＤＷモチーフへと修飾される、請求項１０又は１１に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項13
Ｐが配列番号３１〜配列番号３７から選択されるアミノ酸又はその変異体を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項14
Ｐが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２６、配列番号３１及び配列番号３８から選択されるアミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項15
Ｈがステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による疎水性修飾である、請求項１４に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項16
Ｈがミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による疎水性修飾である、請求項１４に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項17
薬物；プロドラッグ；ラベル；組換えウイルス又はその誘導体；薬物、プロドラッグ若しくはラベル用の担体又はデポー剤；免疫原性エピトープから選択される化合物をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項18
該化合物が、薬物、好ましくはインターフェロン、例えばＩＦＮα、ウイルス逆転写酵素阻害剤、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ウイルスコアアセンブリ阻害剤又はウイルスヌクレオカプシド阻害剤、キナーゼ阻害剤、例えばＲａｆキナーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体、プロテアーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、抗体又はその断片、ｓｉＲＮＡ又はその前駆体、ファルネシル化阻害剤、例えばファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）又はその活性剤、コレステロール生合成阻害剤、ウイルス又は非ウイルス病原体の肝臓段階の阻害剤、抗生剤、から選択される、請求項１７に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項19
該薬物がプロドラッグ形態である、請求項１８に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項20
該化合物が、インターフェロン、例えばＩＦＮαであり、Ｐが好ましくは、配列番号２３又は配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１８又は１９に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項21
Ｈが好ましくはミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による疎水性修飾である、請求項２０に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項22
該化合物が、蛍光色素、放射性同位体及び造影剤から選択されるラベルである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項23
該化合物とＨＢＶの該疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドとが共役体を形成する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項24
該共役体が共有結合又は複合体形成により形成される、請求項２３に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項25
該共役体が化合物とアンカー基Ａとを共有結合することにより形成される、請求項２４に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項26
該アンカー基Ａがスペーサー又はリンカーをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項27
該スペーサー又はリンカーが認識部位を含み、該認識部位は肝タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質、より好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素又はシトクロムにより認識される、請求項２６に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項28
医薬組成物であって、請求項１〜１６、２６及び２７のいずれか一項に記載のＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドを少なくとも１つ、少なくとも、好ましくは請求項１７〜２２のいずれか一項に規定されるような、肝臓、好ましくは肝細胞に特異的に送達される化合物、又は請求項２３〜２５のいずれか一項に規定されるような共役体、並びに任意で薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤、を含む、医薬組成物。
請求項29
肝臓に化合物を特異的に送達するためのビヒクルとしての、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドの使用。
請求項30
該化合物が、請求項１７〜２１のいずれか一項に規定されるようなものである、請求項２９に記載の使用。
請求項31
肝臓への化合物の特異的な送達が肝細胞への該化合物の特異的な送達である、請求項２９又は３０に記載の使用。
請求項32
該化合物を動物、好ましくは哺乳類すなわちヒト、又は鳥類の肝臓に特異的に送達する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の使用。
請求項33
該化合物が肝臓で濃縮される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の使用。
請求項34
該化合物を、肝タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質、より好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素又はシトクロムによって、ＨＢＶの疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドとの共有共役体から切断する、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の使用。
請求項35
肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療のための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は請求項２８に記載の医薬組成物。
請求項36
該肝疾患又は肝障害が、肝炎、肝硬変、ヘモクロマトーシス、好ましくはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型及びＨ型の肝炎ウイルスによって引き起こされる肝炎又はウイルスによって引き起こされる併合肝炎から選択される、請求項３５に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項37
該肝疾患又は肝障害が、肝臓段階のウイルス又は非ウイルス病原体を伴う疾患である、請求項３５又は３６に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項38
該肝疾患又は肝障害が熱帯病、マラリア、住血吸虫症、リーシュマニア症である、請求項３７に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項39
該肝疾患又は肝障害が肝腫瘍、好ましくは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項３５に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項40
該肝疾患又は肝障害が代謝性疾患、好ましくは肥満、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項３５に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド。
請求項41
肝機能の調節のための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は請求項２８に記載の医薬組成物。
請求項42
肝細胞媒介性の抗原提示及び肝臓指向性の免疫反応の活性化のための、請求項１〜２７及び４１のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド疎水性修飾又は請求項２８に記載の医薬組成物。
請求項43
Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染予防のための、好ましくはワクチンとしての請求項１〜２７及び３５〜４２のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は請求項２８に記載の医薬組成物。
請求項44
肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療とＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染予防との組合せのための、請求項１〜２５及び２９〜４３のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は請求項２８に記載の医薬組成物。
請求項45
肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療用の薬剤の製造のための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチド又は請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
請求項46
肝疾患又は肝障害の診断、予防及び／又は治療とＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の感染予防とを組み合わせる方法であって、治療的に効果的な量で、被験体に（ａ）請求項１〜１６、２６及び２７のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと、少なくとも、請求項１７〜２２のいずれか一項に規定されるような化合物とを含む共役体（該共役体は請求項２３〜２５のいずれか一項に規定されるようなものである）、又は（ｂ）請求項２８に記載の医薬組成物、を投与することを含む、方法。
請求項47
投与経路が、皮下、静脈内、経口、鼻腔、筋肉内、経皮、吸入、坐薬によるものから選択される、請求項４６に記載の方法。
請求項48
該治療的に効果的な量が体重１ｋｇ当たり１０μｇ〜１ｍｇの範囲内である、請求項４６又は４７に記載の方法。
請求項49
肝疾患又は肝障害の遺伝子治療のための、請求項１〜１５のいずれか一項に規定されるようなｐｒｅＳ由来ペプチドＰをコードする核酸を含むウイルスベクター。
請求項50
該ウイルスベクターが複製欠損、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４９に記載のウイルスベクター。
請求項51
該ウイルスベクターが肝臓で発現する非相同配列をさらに含む、請求項４９又は５０に記載のウイルスベクター。
請求項52
ＨＢＶ受容体を同定する方法であって、（ａ）請求項１〜１６、２６及び２７のいずれか一項に記載の疎水性修飾されたｐｒｅＳ由来ペプチドと、少なくとも、請求項１７〜２２のいずれか一項に規定されるような化合物とを含む共役体（該共役体は請求項２３〜２５のいずれか一項に規定されるようなものである）、又は（ｂ）請求項２８に記載の医薬組成物、の使用を含む、方法。